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elisa檢測方法有哪些?
更新時間:2022-09-05   點擊次數(shù):1045次
  elisa檢測是酶聯(lián)免疫吸附測定的英文簡稱,是利用抗原抗體結(jié)合專一性,進行免疫反應(yīng)的定性和定量測量方法。通過免疫吸附劑、結(jié)合物、酶反應(yīng)的底物可設(shè)計出各種不同類型的檢測方法。elisa檢測的方法主要有雙抗原夾心法測抗原、雙抗體夾心法測抗體、競爭法測抗體、競爭法測抗原、間接法測抗體、捕獲包被測法測抗體等多種類型。其中間接法測抗體主要用于對病原體抗體的檢測,進行傳染病的診斷。
  ELISA通常分為四種類型:直接法、間接法、競爭法、夾心法等。
  直接法(Direct ELISA)僅需要抗原和酶標(biāo)一抗,操作簡便,可避免交叉反應(yīng),然而該方法要求酶標(biāo)一抗有較高的特異性要求,同時也并非所有的一抗適合標(biāo)記處理。直接法在實際運用中并不多見,它并不能對樣本中抗體進行定量分析,因為樣本中抗體是非酶標(biāo)抗體,無法進行后續(xù)顯色,但是該法經(jīng)過改進就是競爭性ELISA方法,見后文。
  間接法(Indirect ELISA)使用了二抗增加信號強度,也使抗體的選擇多樣化,然而間接法容易產(chǎn)生交叉反應(yīng)。間接法只能用于測定抗體,主要用于疾病的診斷,其優(yōu)點是只需要改變包被抗原,酶標(biāo)抗體是通用的。
  夾心法(Sandwich ELISA)分為雙抗體夾心法和雙抗原夾心法:
  雙抗體夾心法中抗原被兩個抗體——捕捉抗體和檢測抗體,結(jié)合于不同位點。捕捉抗體固定于載體上,檢測抗體通過結(jié)合抗原進行顯色分析。應(yīng)用于雙抗體夾心法檢測的抗體需是單抗,而且對同一抗原結(jié)合位點不同,如此才能避免交叉反應(yīng)或兩種抗體競爭性結(jié)合同一位點。夾心法具有高靈敏度、高專一性的優(yōu)勢,但該法只適用于有多個結(jié)合位點的抗原檢測,主要用于檢測各種大分子抗原——例如在醫(yī)學(xué)檢測中測定HBsAg、HBeAg、AFP等。由于雙抗體夾心法特異性高,在檢測過程中有時會將樣本和酶標(biāo)抗體同時加入進行反應(yīng)(一步法),此時如果樣本中抗原含量過高會導(dǎo)致其與固相抗體和酶標(biāo)抗體均有結(jié)合而不形成“夾心復(fù)合物”,此時測出的結(jié)果將低于實際含量甚至是陰性結(jié)果(鉤狀效應(yīng)hook ffect)。因此,如果使用一步法測定樣本中抗原含量時要注意測量的線性范圍,另外使用高親和力的單抗也可削弱鉤狀效應(yīng)。
  雙抗原夾心法中抗原被包被于固相,檢測樣本中的抗體結(jié)合于抗原后,使用酶標(biāo)的抗原進行結(jié)合及后續(xù)反應(yīng),可以用來測定樣本中的抗體。雙抗原夾心法的關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備,需要根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)進行設(shè)計,在醫(yī)學(xué)檢驗上測定抗HBsAg抗體采用的就是此法,檢測時被測樣本不需要稀釋即可直接進行測定,故此靈敏度相對而言高于間接法。
  競爭法(Competitive ELISA)是用樣本中的游離抗體/抗原與固相的酶標(biāo)抗體/抗原競爭性結(jié)合的分析方法。當(dāng)游離抗體(或抗原)濃度越高,則能與固定抗原(或抗體)結(jié)合的酶標(biāo)抗體(或抗原)就越少,后續(xù)顯色就越淺,即與對照相比,顯色越淺,表示檢測樣本中抗體(或抗原)含量越高。該法適合比較不純的樣本,且重復(fù)性好,但是檢測的靈敏度和專一性較差。競爭法測抗體常常用于檢測某些干擾物質(zhì)不易去除的樣本及難以純化得到抗原等情況。競爭法測抗原常用于檢測小分子抗原及半抗原,這類抗原通常缺乏兩個以上的識別位點,不適用于雙抗夾心法進行測定。
  捕獲包被法也稱為反向間接法,主要用于測定血清中某類抗體亞型如IgM。為排除血清中IgG的干擾,用抗IgM抗體包被后用于捕捉樣本中的IgM,然后加入特異性結(jié)合抗原進行后續(xù)檢測。捕獲包被法常用于對病毒性感染的早期診斷。在測定IgM的實驗中常受到類風(fēng)濕因子(RF,一種能結(jié)合多種動物IgG Fc的自身IgM抗體)的干擾,導(dǎo)致假陽性反應(yīng)。采用F(ab')或Fab片段制備酶標(biāo)抗體可以消除RF的干擾,這一方法在雙抗體夾心法中也具有同樣的效用。
  除了這五種檢測方法,新興的ELISA檢測技術(shù)不斷被開發(fā)出來,例如基于細(xì)胞的ELISA(cell-based ELISA),是將細(xì)胞接種于微孔板中取代原來的抗原,該方法可以對一些處理造成的實時動態(tài)的蛋白含量變化進行測定,無需裂解細(xì)胞,可減少目的蛋白的損失,而其缺點即不能對抗原進行定量分析。
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